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超低温冰箱在保存菌种菌株的应用    【返回  2016-10-17 17:36:30

   先要配制孢子形成培养基。孢子形成培养基时由硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸美、氯化钾及硫酸亚铁及糖类的全部或一部分配制的,PH为4~7,优选为5~6.5。在此配制培养基中加入琼脂,经加热灭菌后冷却凝固,把其产物作为孢子形成培养基。只要能使菌丝增殖和孢子形成,对孢子形成培养基无特别要求,其特征为把PH调至适合孢子形成的4~7范围内。

   具体举例,如在Czapek琼脂培养基(硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸美·7结晶水0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁·7结晶水0.01g/L、蔗糖30g/L、琼脂13g/L)中加入盐酸或硫酸,将PH调至6.0的培养基。再举一例,如在Czapek-Dox琼脂培养基(硝酸钠2g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸美·7结晶水0.5g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸亚铁·7结晶水0.01g/L、葡萄糖30g/L、琼脂13g/L)中加入盐酸或硫酸,将PH调至6.0的培养基。

   用此方法在试管内制成斜面培养基(Slant培养基)或在培养皿内制成平板培养基(Plate培养基),在此培养基上接种菌丝或孢子,在好气条件下进行固体培养。培养温度保持在0~40℃,优选10~35℃,更优选在15~30℃使其增殖和孢子形成。培养温度可在中途改变,例如可使其在25℃条件下增殖后,在5℃条件下培养。

   确认孢子形成后,在固体培养菌丝中添加灭菌水,用常用方法搅拌获得孢子悬浮液。添加于灭菌水中的添加物无特别要求,可为纯水,亦可添加表面活性剂、无机盐类等,还可使用预先调制的生理盐水。搅拌方法可从外部给固体培养容器加力,亦可使用预先灭菌的刷子等直接搅拌菌丝。

  将上述得到的孢子悬浮液或将孢子和菌丝的悬浮液作为保藏原液。此保藏原液可用灭菌水或表面活性剂或含有无机盐类的水溶液稀释后再重新作为保藏原液。之后在此保藏原液中添加冷冻保护剂。对冷冻保护剂的使用一般无特别要求,可从琼脂粉、牛血清、DMSO、甘油、肌醇、聚乙烯醇、脱脂牛奶等中选一种或多种添加。具体举例,如为使保藏液中甘油浓度达到10%,可把甘油作为冷冻保护剂添加。

   添加冷冻保护剂后,将保藏液分装在保藏容器中。容器宜使用灭菌塑料冻存管等,具体举例,如把保藏液在无菌操作条件下分装于容量1.2mL的冻存管中等。之后将此保藏容器置于超低温冰箱内保藏。超低温冰箱内的温度需控制在-100℃~-20℃范围内,优选在-90℃~-30℃,更优选在-85℃~-50℃。

  由此,在超低温冰箱内保藏的菌株可长时间、稳定地保藏。

 
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